基于靶向代谢组学研究方法探究芍药内酯苷通过调节肠道菌群抗抑郁的机制

抑郁症（Depression）是一种严重的情感障碍性精神疾病,以显著而持久的心境低落为主要临床特征。目前临床使用的合成抗抑郁药物虽然有一定的疗效,但起效迟缓、疗效低或有强烈的副作用。探究抑郁症复杂的发病机制,为寻找治疗抑郁症的药物作用新靶点、开发出疗效更好和副作用更低的抗抑郁药物成为当今研究的热点。本课题组在前期工作中分别探究了芍药总苷、芍药苷和芍药内酯苷的抗抑郁效果,发现三者均有一定的抗抑郁作用,芍药内酯苷的抗抑郁作用优于芍药苷和芍药总苷,且抗抑郁效果具有剂量依赖性。本次研究是在此基础上采用经典的大鼠慢性温和不可预知性应激（Chronic unpredictable mild stress,CUMS）抑郁症模型,考察芍药内酯苷的快速抗抑郁作用,并运用新一代靶向代谢组学（Next-generation targeted metabolomics）技术,研究分析大鼠海马组织中和肠道内的代谢产物水平,揭示芍药内酯苷抗抑郁的分子药理学机制。通过构建慢性温和不可预知性应激抑郁大鼠模型,分别将抗抑郁药氟西汀和快速起效抗抑郁药氯胺酮作为阳性药对照,考察芍药内酯苷对CUMS模型大鼠体重、1%糖水偏好实验和开放场（Open field test,OFT）实验中的抗抑郁效果。结果显示,在大鼠CUMS模型中,连续给予芍药内酯苷7天后,可明显逆转CUMS模型大鼠体重的下降和1%糖水偏好的减少,以及开放场实验中活动总距离和直立次数的减少;而连续给药7天的氟西汀（10 mg/kg）组对模型大鼠的1%糖水偏好影响,与CUMS组相比无显著性差异。单次给药氯胺酮（10 mg/kg）和芍药内酯苷（7 mg/kg）均可明显逆转CUMS模型大鼠1%糖水偏好的减少,且氯胺酮和芍药内酯苷之间没有统计学差异,表明芍药内酯苷具有快速起效的抗抑郁作用。开展了芍药内酯苷的药代动力学研究,大鼠灌胃给予芍药内酯苷（7 mg/kg）后,在预定的时间点眼眶后静脉丛取血,在每个时间点收集血液后处死大鼠并迅速分离大鼠脑海马组织,采用LC-MS/MS法测定血浆和海马组织中芍药内酯苷的含量变化。结果显示,大鼠在灌胃后5 min就可以在血浆中检测到芍药内酯苷,大鼠海马区芍药内酯苷浓度在45 min时达到峰值(T_max)。药代动力学结果进一步表明了芍药内酯苷的快速起效作用。开展了芍药内酯苷对CUMS抑郁模型大鼠抗抑郁机制研究。大鼠海马组织靶向代谢组学研究结果显示,芍药内酯苷可以恢复海马组织中的代谢紊乱,调节代谢产物水平,调控苯丙氨酸、酪氨酸、谷氨酸和色氨酸代谢通路。蛋白表达（Western Blot）研究结果显示,在大鼠海马和伏隔核（NAc）区,与CUMS模型组相比,芍药内酯苷连续给药7天后可快速上调环磷腺苷效应元件结合蛋白（c AMP-response element binding protein,CREB）、磷酸化的c AMP反应原件结合蛋白（Phosphorylated Camp Response Element Binding Protein,p CREB）、酪氨酸激活酶B（Tropomyosin-related kinase B receptor,Tr KB）和磷酸化的酪氨酸激活酶B（phosphorylated tropomyosin related kinase B,p Tr KB）的表达;在海马区,芍药内酯苷给药7天后脑源性神经营养因子（Brain derived neurotrophic factor,BDNF）表达显著上调,氟西汀治疗组则没有影响,另外,芍药内酯苷显著下调N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptor,NMDA）B亚型谷氨酸受体离子型（NMDA Receptor 2B,GLu N2B）的表达水平,发挥了与氯胺酮类似的作用。大鼠粪便靶向代谢组学研究结果显示,CUMS诱导大鼠肠道菌群代谢失调,给予芍药内酯苷治疗后使得大鼠整体肠道微生物代谢趋向正常代谢,调节慢性应激诱导的肠道代谢紊乱,调控花生四烯酸和酪氨酸等代谢通路。为了进一步验证肠道微生物在芍药内酯苷抗抑郁效果中的作用,我们通过灌胃和饮水对大鼠肠道菌群进行广谱抗生素干预。构建了抗生素诱导的肠道微生物耗竭（Antibiotic-induced microbial depletion,AIMD）模型。以粪便细菌DNA负荷和肠道微生物代谢产物水平较正常对照组大鼠显著降低,以及AIMD组的苯甲酸含量显著减少为评估指标,表明肠道微生物组清除成功。然后,使用CUMS抑郁症模型大鼠评估AIMD对芍药内酯苷抗抑郁活性的影响。结果显示,OFT检测中,芍药内酯苷治疗的AIMD组仅部分校正了由慢性应激引起的直立次数和活动总距离的减少。海马靶向代谢组学结果显示,AIMD部分消除了芍药内酯苷对CUMS模型大鼠海马代谢紊乱的修复,影响海马的色氨酸、酪氨酸和花生四烯酸代谢通路。与芍药内酯苷处理的普通CUMS抑郁症模型大鼠相比,AIMD导致CUMS抑郁症模型大鼠对芍药内酯苷治疗的响应显著不同。结论,芍药内酯苷可以作为一种潜在的快速抗抑郁候选药物。芍药内酯苷的主要抗抑郁作用机制为:芍药内酯苷通过调节酪氨酸、色氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸和花生四烯酸代谢通路来发挥抗抑郁作用;芍药内酯苷可以恢复由CUMS诱导的代谢紊乱,其原因是肠道微生物及其代谢酶将芍药内酯苷分解转化为代谢产物苯甲酸,恢复肠道菌群失调,调节肠道微生物组成和功能,提高芍药内酯苷在体内的生物利用度,从而发挥抗抑郁效果。