坛紫菜酶解多糖的分离纯化及生物活性研究
Isolation,Purification and Biological Evaluation of Enzymatic Hydrolysate of Polysaccharide from Porphyra Haitanensis
坛紫菜属红藻纲,红毛菜科,俗称紫菜、乌菜,主要在我国福建、浙江等南部沿海地区多有种植,富含蛋白质、多糖和维生素,是一种食用与药用价值很高的海藻植物,所以很受人们的欢迎.紫菜味美价廉,资源丰富,综合这些特性,紫菜成为了一个研究热点.由于坛紫菜粗多糖的分子量较大,生物活性较低,为了提高坛紫菜多糖的利用价值,本文以坛紫菜粗多糖为原料,利用酶法降解粗多糖,然后将降解多糖用DEAE-52纤维素柱和SephadexG-100凝胶柱分离纯化,对各多糖组分的组成及结构进行了表征,并研究了其生物活性.本论文的主要研究结果如下:1、利用水提醇沉法提取坛紫菜粗多糖(CPH).用酶法降解粗多糖,以DPPH清除率为指标,对果胶酶、糖化酶、纤维素酶、淀粉酶、脂肪酶进行筛选,最后选择了 DPPH清除率较高的果胶酶.用响应面法对果胶酶水解条件进行优化,得到的最佳工艺参数为:果胶酶浓度为50 U/mL,pH为5.0,温度为47.5 ℃,在此条件下反应2 h,得到降解多糖(DCPH).2、DCPH胆汁酸结合能力和抗氧化活性都明显强于CPH.其中对牛磺胆酸钠和鹅去氧胆酸钠的结合能力较强,表现出潜在的降低胆固醇的功能.CPH和DCPH对DPPH清除率的IC50分别17.55mg/mL、7.26mg/mL.CPH和DCPH对羟自由基清除率的IC50分别12.32 mg/mL、7.83 mg/mL.3、先用DEAE-52离子交换柱对DCPH进行分离纯化,收集0.3 M、0.5M、0.7M的NaCl洗脱出的多糖,然后用SephadexG-100进一步纯化,将纯化后的多糖分别命名为P1、P2、P3.4、对P1、P2、P3进行组成分析和结构表征.结果表明,与CPH和DCPH相比,P1、P2、P3的总糖含量以及硫酸根含量都得以增加,蛋白质含量则降低.紫外可见光谱图显示没有核酸、蛋白质的吸收峰.红外扫描光谱图显示经酶解和分离纯化后的多糖的主要结构和基团没发生变化;另外,红外光谱、核磁共振氢谱和碳谱分析都表明P1、P2和P3都含有α型糖苷键和β型糖苷键.GC-MS分析结果表明:CPH、DCPH、P1、P2、P3均主要由半乳糖组成,还含有少量的葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、岩藻糖、木糖、鼠李糖.高效凝胶渗透层析法(HPGPC)测得P1、P2、P3的分子量分别是300.3kDa、130.4kDa和115.1kDa,与未降解多糖CPH相比,分子量有了明显降低(CPH分子量为523kDa).5、P1、P2、P3对DPPH清除率的IC50分别为6.28 mg/mL、5.82 mg/mL、5.17 mg/mL;对羟自由基清除率的IC50分别为7.05 mg/mL、5.87 mg/mL、6.53 mg/mL.还原力大小 P3>P2>P1.6、本实验选择RAW264.7巨噬细胞为研究对象.(1)MTT法检测细胞的增值能力:当浓度在12.5μg/mL-100μg/mL范围内,细胞增殖能力呈现上升的趋势,且刺激24h的效果优于48h.P2和P3能够较好的促进巨噬细胞的增殖,当浓度为100 μg/mL,P2和P3的细胞增值能力是空白组的5.6和4.8倍.(2)中性红法测细胞的吞噬能力:与空白对照组相比,PI、P2、P3能显著提高细胞的吞噬能力,具有剂量依赖性.(3)Griess试剂法检测细胞NO释放能力的影响:当刺激时间为48 h时,空白组的NO释放量为14.6 μmol/L,在多糖浓度为400 μg/mL 时,CPH、DCPH、P1、P2、P3 的 NO 释放量分别为 98.46、127.06、110.28、140.71、146.28 μmol/L.
- 作者：
- 李银停
- 学位授予单位：
- 浙江工商大学
- 专业名称：
- 食品科学与工程
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2019年
- 导师姓名：
- 周涛
- 中图分类号：
- TS254.58
- 关键词：
- 坛紫菜多糖；酶解；分离纯化；抗氧化；RAW264.7；免疫活性
- Polysaccharides from Porphyra haitanensis; Enzymatic hydrolysis; Isolation and purification; Antioxidant activity; Immune activity;