藏药波棱瓜子总木脂素对肝纤维化的保护作用及机制探讨

目的:肝纤维化是各种慢性肝病进一步发展为全肝性肝硬化甚至是肝癌的重要环节.[1-3]目前,临床在治疗肝纤维化上尚无安全有效的药物,而近年来中药及天然产物在肝纤维化的防治中所展现的良好效果越来越受到研究者的重视.本次研究药物是我国传统藏药波棱瓜子,其为波棱瓜的干燥成熟种子,属葫芦科.初步研究表明,其化学成分主要包括脂肪酸、木脂素、氨基酸和多糖.[4]已报道的波棱瓜子提取物显示出广泛的生物活性,包括保肝、抗疲劳、耐缺氧和抗病毒活性.进一步研究表明,波棱瓜子防治肝病的主要有效成分为总木脂素,其对于治疗各种肝脏炎症,如病毒性肝炎、酒精肝和化学性肝损伤都具有良好的疗效,而这些肝脏炎症和损伤是肝纤维化发生的基础.[5-6]然而关于波棱瓜子总木脂素预防和治疗肝纤维化的研究还未见报道,作用机制也尚不明确.故本研究拟建立四氯化碳致大鼠肝纤维化型,研究其是否对大鼠肝纤维有保护作用.继而通过体外培养大鼠肝枯否细胞和肝星状细胞探讨波棱瓜子总木脂素抗肝纤维化的作用机制.方法:1.藏药波棱瓜子总木脂素部位对四氯化碳致大鼠肝纤维化的保护作用:(1)四氯化碳致大鼠肝纤维化模型的建立:SD大鼠腹部皮下注射含40%四氯化碳(CCl4)的橄榄油溶液,首次注射5 ml/kg,而后每隔两到三天注射3 ml/kg,连续造模9周.期间记录大鼠的状态和体重变化.SD大鼠随机分为空白组、模型组、甘利欣(阳性药)组、总木脂素(100 mg/kg)组、总木脂素(200 mg/kg)组和总木脂素(400 mg/kg)(以下简称总木脂素低、中、高剂量组)共六组.除空白组外均建立四氯化碳致大鼠肝纤维化模型,每天按剂量灌胃给药,空白组和模型组每天灌胃等量生理盐水.(2)应用自动生化仪检测大鼠血清中肝功能指标丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)的水平;(3)通过组织病理检测大鼠肝脏组织形态,Masson三色胶原染色检测大鼠肝脏纤维结缔组织的增生情况;(4)ELISA法检测大鼠血清中肝纤维化指标转化生长因子(TGF-β1)、透明质酸(HA)、羟脯氨酸(HYP)的水平和大鼠肝匀浆超氧化物歧化酶(SOD)水平.2.藏药波棱瓜子总木脂素部位对大鼠肝星状细胞增殖和凋亡的影响:实验分为对照组、秋水仙碱(0.1μg/ml)(阳性药)组、总木脂素(20μg/ml)组、总木脂素(30μg/ml)组和总木脂素(40μg/ml)(以下简称总木脂素低、中、高剂量组)共六组.取对数生长期的肝星状细胞,加入各组对应药物进行培养,采用CCK8法测定波棱瓜子总木脂素对肝星状细胞24、48、72h的增殖抑制率,通过流式细胞仪检测波棱瓜子总木脂素对肝星状细胞凋亡和细胞周期的影响.3.藏药波棱瓜子总木脂素部位对大鼠肝纤维化的保护作用机制探讨:(1)实验分为对照组、模型组(LPS)、秋水仙碱(0.1μg/ml)(阳性药)组、总木脂素(30μg/ml)组、总木脂素(40μg/ml)组和总木脂素(50μg/ml)(以下简称总木脂素低、中、高剂量组),取对数生长期的枯否细胞,除对照组外先加入药物培养24 h后加入LPS继续培养6 h,提取细胞上清液.通过ELISA法检测波棱瓜子总木脂素对大鼠原代肝枯否细胞中TGF-β1、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达的影响.(2)实验分组同2,采用Western blot法检测波棱瓜子总木脂素对肝星状细胞中核因子-κB(NF-κB)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)和Bcl-2相关X蛋白(Bax)的表达.结果:1.藏药波棱瓜子总木脂素部位对四氯化碳致大鼠肝纤维化的保护作用:(1)与空白比较,模型组肝脏经病理和Masson三色胶原染色发现肝细胞坏死严重、大量纤维结缔组织增生,有假小叶形成,提示四氯化碳致大鼠肝纤维化模型成功.(2)与模型组比较,波棱瓜子总木脂素组大鼠血清中肝功能指标ALT、AST、ALP的水平明显降低(P<0.05,P<0.01);肝脏组织匀浆液中SOD浓度明显升高(P<0.05,P<0.01);肝脏损伤程度明显减轻,纤维结缔组织明显减少,肝纤维化评分降低;大鼠血清肝纤维化相关指标HA、HYP、TGF-β1含量显著降低(P<0.05,P<0.01).2.藏药波棱瓜子总木脂素部位对大鼠肝星状细胞增殖和凋亡的影响:与对照组相比,波棱瓜子总木脂素组对HSC-T6细胞24、48、72 h时的增殖抑制率明显增高(P<0.01),各组HSC-T6细胞早期凋亡率与晚期凋亡率明显升高(P<0.05,0.01),G0/G1期细胞数明显增多(P<0.01),G2/M期细胞数无明显差异(P>0.05),S期细胞数明显减少(P<0.01),说明波棱瓜子总木脂素可以使HSC-T6发生G1期阻滞来抑制其增殖.3.藏药波棱瓜子总木脂素部位对大鼠肝纤维化的保护作用机制探讨:(1)与对照组相比LPS可以促进枯否细胞分泌TGF-β1和TNF-α(P<0.05,0.01).文献表明TGF-β1和TNF-α均有促肝纤维化发展的作用,而与模型组比较波棱瓜子总木脂素可以显著降低枯否细胞上清液中TGF-β1和TNF-α的水平(P<0.05,0.01).(2)用药物处理肝星状细胞后,与对照组相比,波棱瓜子总木脂素能显著降低NF-κB和Bcl-2蛋白的表达.波棱瓜子总木脂素高剂量组能显著升高Bax蛋白的表达.结论:综上所述,大鼠体内实验表明藏药波棱瓜子总木脂素部位对四氯化碳致大鼠肝纤维化有明显的保护作用,对肝脏损伤的修复和减少纤维结缔组织增生均有明显效果,而对大鼠肝纤维化的保护作用可能与波棱瓜子总木脂素降低肝损伤相关酶活性和降低HA、HYP、TGF-β1含量有关.体外细胞实验表明,藏药波棱瓜子总木脂素部位对肝纤维化的保护作用与其可以抑制肝星状细胞的增殖并诱导肝星状细胞的凋亡有关.同时可能与其可以抑制枯否细胞分泌促肝纤维化的相关细胞因子TGF-β1和TNF-α有关;而波棱瓜子总木脂素抑制肝星状细胞的增殖与其可以降低相关蛋白NF-κB和Bcl-2有关.