茶树体内谷氨酸脱羧酶(GAD)基因的克隆、表达及调控机制研究
Cloning, Expression and Regulatory Mechanism of Glutamate Decarboxylase(GAD) in Tea(Camellia Sinensis(L.)O.Kuntze)
γ-氨基丁酸是(GABA)是一种广泛存在于生物体中的非蛋白质氨基酸,对动、植物和微生物均有着重要的生理功能.植物体内的GABA主要由谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD)催化产生.近年来,人们关注如何改良加工方式提高采摘后茶叶中GABA的含量以制备"Gabaron"茶,对于茶树体内的GABA代谢与调控模式,包括如何通过品种选育与改良以提高茶叶中GABA的含量等方面研究较少.因而,本试验采用RACE-PCR技术从'舒茶早'中克隆了GAD1,并通过体外实验验证了其功能,GAD1在不同组织器官中的表达量通过qRT-PCR检测.同时克隆了 GAD1的启动子,通过生物信息学软件Plant care分析该启动子序列,获得了可能调节GAD1基因表达的关键基序.该研究旨解析GABA在茶树中的代谢与调控模式,阐明茶叶中GABA的富集原理;并对高含量GABA茶树品种的选育及栽培措施的改良提供帮助.1.茶树中不同叶位GABA的检测结果不同叶位的GABA的含量中,芽中的GABA的含量普遍偏高,其中一芽一叶中的芽最高,叶片中的GABA的含量相对偏低,一芽二叶中的第一叶最低.2.茶树中谷氨酸脱羧酶GAD1的cDNA全长的获得应用RACE技术获得了 CsGAD1的cDNA序列为2054bp,其开放阅读框全长为1482bp,共编码493个氨基酸.该蛋白为一种细胞质蛋白,其分子量大小为55.49kD,理论的等电点为5.44.该蛋白为非分泌蛋白,不存在明显的跨膜区域,也为亲水性蛋白,可能的磷酸化位点共有23个,其二级结构中,α-螺旋占13.62%,β-折叠结构占19.25%,无规则卷曲及其它结构约占67.14%.与人参、玉米、葡萄的亲缘性较近.3.茶树中G4D1基因的原核表达分析构建了 pMAL-C4X-CsGAD1表达载体及以Ecoli.Rosetta good为宿主菌的原核表达体系.IPTG诱导后,制取样品进行SDS-PAGE,检测得到分子量为55kDa大小的目的蛋白.4.茶树中GAD1的gDNA的获得通过TAIL-PCR技术扩增出茶树中GAD1基因的gDNA序列,全长为4527bp,与cDNA比对结果发现其序列中含有7个外显子,6个内含子.5.茶树中不同组织器官的G4D1表达量通过qRT-PCR技术揭示茶树中不同组织器官的CsGAD1的分布,其中主侧根中CsGAD1的表达量最高,其它各个组织器官表达量相差不大,单芽、成花、上胚轴、及须根表达量接近.一芽一叶中的单叶表达量最低.6.茶树中GAD1的启动子克隆及相关信息元件的功能验证应用Genome walking的PCR方法,克隆出CsGAD启动子序列约为1500bp应用PlantCare软件对其中1500bp的片段进行分析,发现其转录起始位点位于ORF框上游的193bp处,其中存在许多与基因表达有关功能性的顺式作用元件如:光诱导元件LAMP,低温响应元件LTR以及ABA应激元件ABRE等等.对茶苗进行喷施ABA处理并利用qRT-PCR检测CsGAD1表达量,结果发现,ABA诱导了茶苗根部与叶部的CsGAD1基因的表达,且不同组织的表达量具有一定的差异性.
- 作者：
- 孟祥宇
- 学位授予单位：
- 安徽农业大学
- 专业名称：
- 茶学
- 授予学位：
- 硕士
- 学位年度：
- 2015年
- 导师姓名：
- 宛晓春；陈琪
- 中图分类号：
- S571.1
- 关键词：
- GAD1；GABA；启动子；ABA；茶树
- Glutamate decarboxylase; Gamma-aminobutyri acid; Promoter; ABA Cam; ellia sinensis;